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两株菌按 1:1 混在一起培养，6 小时后谁占了上风？CFU 平板只能给出总数，给不出比例。2026 年 mLife 发表的一篇鲍曼不动杆菌论文，把 mCherry 红色荧光蛋白装进参照株，涂板之后用 LUYOR-3421 台式荧光蛋白激发光源判读菌落，红色与不发光两群直接分开计数。原文方法部分写得很明确：Colony ratios were determined using a LUYOR-3421 benchtop fluorescent protein excitation source and further confirmed by PCR with ISAba1-F/ISAba1-R primers。这篇把这一步拆开讲：标记怎么设、波段怎么配、平板怎么判、误差从哪里来。
竞争实验（competition assay）的逻辑很朴素：把待测株和参照株等比例混合，培养一段时间后看两株的比例往哪边偏。竞争指数（competitive index，CI）大于 1 说明待测株占优，小于 1 说明它在吃亏。问题在于，混合之后两株在平板上长得一模一样，CFU 总数无法拆分成两个种群。
常见的分型手段有三种，各有各的代价：
| 方法 | 做法 | 局限 |
|---|---|---|
| 双抗生素标记 | 两株各带一种抗性，分别涂两种选择平板 | 临床株背景耐药谱复杂，常常找不到两个干净标记；加两种抗生素还会改变生长速度 |
| 逐菌落 PCR | 每板随机挑 20–24 个单菌落做菌落 PCR 分型 | 结果可靠，但工作量大，抽样比例低会带来统计误差 |
| 荧光蛋白标记 | 一株稳定表达 mCherry，整板按颜色分群计数 | 需要激发光源；表达弱或菌落老化时判读依赖经验 |
荧光标记的好处是不用挑菌、不用二次培养、整板一眼分群，一块板几十秒就能数完。它的代价是判读环节被引入了新的变量：光源强度、照射角度、环境光、菌落年龄都会影响「看到红」与「看不到红」的边界。所以真正决定数据质量的，不是买不买灯，而是判读条件是否固定、可复现。
这项工作由中国科学院微生物研究所微生物多样性与创新利用国家重点实验室完成，研究对象是鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）。作者先分析了 7490 个基因组（582 个完成图加 6908 个草图），发现由两个 ISAba1 夹着 crp 与 osmC 的片段会以多拷贝形式扩增，这个复合转座子被登记为 Tn7691。在 582 个完成图里，该位点扩增出现在 19 株（3.3%），拷贝数 2–8；携带 Tn7691 或发生扩增的菌株全部属于 ST2 及其单基因座变异型。
为了在实验室里重现这种扩增，作者把「ISAba1-crp-osmC」序列克隆进 pKFAb 质粒，电转入 ATCC 19606，得到模拟扩增株；qPCR 证实 crp 拷贝数升高 6.23 ± 1.97 倍。同时构建了空载对照与 mCherry 标记对照：
| 菌株 / 质粒 | 荧光标记 | 在实验中的角色 |
|---|---|---|
| 19606 (pKFAb) | 无 | 空载对照，用于生长曲线与转录组比较 |
| 19606 (pKFAb:crp-osmC) | 无 | 模拟 crp-osmC 扩增的待测株 |
| 19606 (pKFAb:mCherry) | 红色荧光 | 竞争实验的参照株，平板上呈红色 |
| 临床 ST2 株 (pKF-ble / pKF-ble:crp-osmC) | 无 | 用博来霉素抗性替代卡那，逐菌落 PCR 分型 |
培养条件统一：BHI 液体培养基，37 °C、200 rpm；平板为 LB 琼脂，卡那霉素 50 mg/l（临床株实验用博来霉素 200 mg/l）。竞争实验的起始浓度是 5 × 106 CFU/ml，按 1:1 混合，37 °C 共培养，在 0、3、6 小时取样，系列稀释后涂板。
先把结论摆出来，因为后面的判读方法都是为这组数字服务的：
| 实验体系 | 取样时间 | 竞争指数（CI） |
|---|---|---|
| 体外 BHI 共培养 | 3 h | 3.06 ± 0.88 |
| 体外 BHI 共培养 | 6 h | 3.45 ± 0.67 |
| 小鼠肺部定植 | 24 hpi | 3.56 ± 0.97 |
| 小鼠肠道定植 | 24 hpi | 2.12 ± 0.79 |
| 小鼠血清共孵育 | 3 h | 3.09 ± 1.84 |
| 小鼠血清共孵育 | 6 h | 9.00 ± 5.69 |
| 环磷酰胺免疫抑制模型肺部 | 24 hpi | 5.54 ± 1.98 |
生长曲线上，扩增株在约 12 小时后开始拉开差距，稳定期 OD600 更高；单独扩增 crp 或单独扩增 osmC 都没有这个效果，两个基因同时多拷贝才有表型。血清杀菌实验中，扩增株 3 小时与 6 小时的存活分别是参照株的 3.49 ± 1.34 倍与 7.05 ± 2.75 倍。转录组指向苯丙氨酸代谢、铁载体合成与硫代谢三条通路；同时生物膜形成下降、对 β-内酰胺类、多黏菌素 B、环丙沙星与氯霉素的敏感性上升，作者把它解释为「宿主适应性与耐药性之间的权衡」。
这些数字的量级值得注意：CI 落在 2–9 之间，意味着两群菌落的比例差异通常只有两倍到九倍，不是「一边倒」的悬殊差别。计数时少算或多算十几个菌落，就足以让 CI 偏移 10% 以上。判读的稳定性，直接决定结论能不能站住。
原文对这一步的交代只有一句，但位置很关键：它发生在稀释涂板之后、PCR 复核之前，作用是把一整块平板上的菌落分成「红」与「不发光」两群，给出比例；随后的 PCR 用 ISAba1-F/ISAba1-R 引物确认红色菌落确实携带对应质粒。体内实验同理——肺组织与粪便匀浆涂板后，同样按红色荧光与非荧光计数，再算竞争指数。
换句话说，仪器在这里承担的是判读，不是成像定量。它不需要拍出漂亮的荧光照片，只需要让操作者在固定条件下稳定地区分两群菌落。这也解释了作者为什么选台式机型而不是手持灯：平板要一块接一块地看，时间点要跨 0、3、6 小时反复计数，位置、角度、亮度必须每次都一样。
mCherry 的激发峰在 587 nm、发射峰在 610 nm，属于红色荧光蛋白。LUYOR-3421 的 GR 模组以 510–540 nm 绿光激发、配 590 nm 长通滤光片，正好落在 mCherry 激发曲线的短波一侧。
| 荧光蛋白 / 染料 | 激发峰 | 发射峰 | 3421 模组 | 发射滤光片 |
|---|---|---|---|---|
| mCherry、DsRed、tdTomato | 587 nm | 610 nm | GR（510–540 nm） | 590 nm 长通 |
| GFP、eGFP、FITC | 488 nm | 507 nm | RB（440–460 nm） | 495 nm 长通 |
| YFP、Venus | 513 nm | 527 nm | CY（490–515 nm） | 550 nm 长通 |
| CFP | 433 nm | 475 nm | VI（400–415 nm） | 450 nm 长通 |
| DAPI、Hoechst | 358 nm | 461 nm | UV（360–380 nm） | 415 nm 长通 |
需要说明一个技术细节：510–540 nm 并不是 mCherry 的激发峰值，用它激发得到的是吸收曲线肩部的信号，强度低于 560–590 nm 激发。但菌落里 mCherry 表达量高、蛋白集中，做「有 / 无」的二分类判读足够；如果要做弱表达菌株的定量比较，或者需要测量荧光强度而非计数，就应该换用更长波长的激发或直接上荧光成像系统。这一条界限要划清楚，避免把定性工具当定量仪器用。
如果实验同时带 GFP 与 mCherry 两种标记，主机配 RB 与 GR 两套模组即可，BNC 接口拔插换装，几秒完成，不需要重新调光路。
按这篇论文的场景（90 mm 平板、过夜培养、两群菌落混合分布），可以整理成一套可复制的流程：
每个平板 30–300 个菌落比较合适。密度太高菌落连片，红色与不发光混在一起就无法单独计数；密度太低，统计波动大。做 10 倍系列稀释，选两个连续梯度涂板，取落在区间内的那一块计数。
涂板后 18–24 小时计数。菌落再放下去，mCherry 的红色会随菌落老化变暗，边缘先褪色，容易出现「同一块板上午数 120、下午数 96」的情况。需要复核就把平板放 4 °C 避光，不超过两天。
空载株（无荧光）的平板用来确定阴性阈值——在这块板上完全看不到的红信号，才算「不发光」；mCherry 单株的平板用来确定阳性强度。两块对照必须在同一亮度档位下看，否则阈值没有意义。
把 500 mm 鹅颈弯到 30–45° 斜上方，让光均匀铺满整皿。正面直射会在琼脂表面形成反光带，盖住一部分菌落；斜照还能让菌落边缘的荧光更立体。操作时不要正视灯头。
不需要暗室。关掉台面直射灯、拉上窗帘、避开窗口反光即可。20 W LED 的输出在普通室内光线下足以让红色菌落清晰可辨；把环境光控制到每次一致，比每次都把房间弄全黑更实用。
在皿底画十字分四区，逐区点数并记录。67 mm 拍照滤镜可以直接接单反，把整板拍下来——照片不只是存档，出现争议时可以重新判读，比回忆当时看到什么可靠得多。
| 判读参数 | 建议设置 | 原因 |
|---|---|---|
| 平板菌落数 | 30–300 个 | 避免连片，兼顾统计效力 |
| 光源角度 | 30–45° 斜照 | 减少琼脂表面镜面反射 |
| 亮度档位 | 全批实验固定同一档 | 保证阈值可比 |
| 环境光 | 关闭直射灯、避开窗口 | 提高红/不红对比度 |
| 判读时间 | 涂板后 18–24 h | 菌落成熟、荧光稳定 |
| 记录方式 | 分区计数 + 拍照留档 | 结果可复核、可追溯 |
CI 的数值是靠两个菌落数相除得到的，分子分母任何一边出错都会直接放大。实际操作中反复出现的问题集中在六处：
| 现象 | 常见原因 | 处理办法 |
|---|---|---|
| 红群数量偏低 | 菌落老化、荧光衰减；判读时把暗红当成阴性 | 24 小时内计数；固定亮度档位；弱信号用拍照复判 |
| 红群数量偏高 | 琼脂或培养基自发荧光；阴性阈值定得太松 | 同批培养基；每批带一块空载株平板定阈值 |
| 两群都偏少 | 质粒丢失；抗生素失效 | 卡那霉素 50 mg/l 维持选择压；抗生素现配现用 |
| 重复性差 | 照射角度、距离每次不同 | 台式固定位置；鹅颈角度做标记；不随意挪动机身 |
| 菌落连片无法分辨 | 稀释不足或涂布不均 | 调整稀释梯度；涂布棒均匀推干 |
| 结果与 PCR 不符 | 荧光判读的假阳性 / 假阴性 | 挑取菌落做菌落 PCR 复核；论文中临床株组每板随机挑 20–24 个 |
还有一条容易被忽略：荧光判读的假阴性会系统性压低待测株的比例。红色菌落若因为表达弱被记成阴性，CI 会朝着与真实情况相反的方向偏移，而且这种偏移不会随机抵消。所以对照板、固定档位、拍照留档这三件事不是「规范动作」，而是数据可信度的前提。
LUYOR-3421 的定位是「体视显微镜荧光适配器 + 独立台式激发光源」。在这类竞争实验里用到的是第二种形态：机身放在台面上，鹅颈把灯头伸到平板上方，双手完全空出来做标记和点数。
| 项目 | 参数 |
|---|---|
| 光源 | 20 W 大功率 LED，照射面积大、光斑均匀 |
| 波长模组 | 6 组：UV / VI / RB / RB-GO / CY / GR，BNC 快速接口换装 |
| 对应波长 | 365、405、450、488、505、530 nm |
| 灯臂 | 500 mm 柔性鹅颈，可任意弯折定位 |
| 调光 | 标配调光器，亮度连续可调 |
| 拍照 | 67 mm 拍照滤镜，可直接接单反 |
| 显微镜适配 | 适配环夹装立柱，免改装、秒装秒拆 |
| 供电 | 110–220 V AC，50/60 Hz |
它的第二个用法在需要看细节时派上用场：把适配环装到体视显微镜上，阻隔滤光片插入物镜下方光路，就能在放大条件下看单菌落的表达分布、或者确认菌落边缘是否真的发红，而不是被琼脂背景干扰。
同系列其他机型的定位不一样，按场景选就行：
判断标准其实只有一条：样品是「拿到灯前」还是「灯拿到样品前」。平板计数、批量比较、需要跨时间点反复判读的，用台式；需要在不同房间、不同设备之间流动的，用手持。
不一定。587 nm 是它的激发峰，用峰值激发信号强；但菌落判读只需要区分「有」和「无」，510–540 nm 的绿光足以激发出可辨的红色信号。真正要在意的是每次用同一波段、同一强度，而不是追求峰值。
不需要。关掉直射灯、避开窗口反光即可。需要控制的是环境光的稳定性——如果这次在暗室、下次在明亮台面，两次的判读阈值就不一样了。
先排除三种情况：菌落是否太老（超过 24 小时红色会衰减）、平板是否在 4 °C 放了太久、质粒是否丢失。都排除之后仍然很暗，才考虑表达量本身偏低。这种情况下不要硬判为阴性，挑出来单独做 PCR 更稳妥。
要做。这篇论文自己就是这么做的：3421 给出菌落比例，PCR 用 ISAba1-F/ISAba1-R 确认红色菌落的身份；临床株那一组更是每板随机挑 20–24 个单菌落逐一 PCR 分型。荧光判读负责效率，PCR 负责定性。
30–300 个是常用区间。低于 30 个统计波动大，高于 300 个菌落开始连片、红色互相叠加。混合竞争实验里两群菌落是随机分布的，密度控制得越均匀，CI 的重复性越好。
看工作方式。判读台固定、样品成批送过来、需要拍照留档的，选 3421；需要在培养箱、温室、田间之间带着走、一个人边搬边看的，选 3415RG。两者波段覆盖相同，差别在形态与照射面积。
这篇论文的方法学价值，不在于「用了哪台灯」，而在于把一个容易被含糊处理的环节写清楚了：竞争实验的分型靠荧光标记，荧光标记的判读靠固定条件。1:1 混合、3 小时与 6 小时取样、每板 20–24 个菌落 PCR 复核——这些细节加起来，才让 CI = 3.06 这个数字可信。
对做同类实验的实验室来说，可复制的经验有三条：标记株要带稳定表达、判读台要固定不动、每批实验都要有阴性与阳性对照板。设备选型只是其中一环，但这一环决定了你数出来的是数据，还是噪声。如果正在搭建细菌竞争或定植实验的判读流程，可以把菌株标记方式、平板规格与单批样本量发给我们，一起看波段与机型怎么配更顺手，也可以直接通过联系我们留言。
