LUYOR-3415RG 应用：Nature 2025 苜蓿研究中的 eGFP 菌落荧光计数

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豆科植物既能与根瘤菌互利共生，又能抵抗病原菌侵染——这层「共生-免疫」平衡背后的机制，是植物-微生物互作领域的核心问题。2025 年 5 月发表于 Nature 的一项研究（中国科学院分子植物科学卓越创新中心王二涛团队）鉴定出胞质激酶 MtLICK1/2，揭示了它如何与结瘤因子受体 MtLYK3 协同：一方面相互磷酸化、放大共生信号，另一方面在根瘤菌侵染区抑制植物免疫。这项研究的免疫学实验里，有一个看似不起眼却关键的步骤——在培养皿上数发绿色荧光的菌落，用的正是 LUYOR-3415RG 双波长荧光蛋白激发光源。本文按这项研究的工作流程，讲清荧光计数在植物-细菌互作实验中的用法。

一、论文速览：MtLICK1/2 的发现意味着什么

研究团队以 MtLYK3 的胞质内结构域为诱饵，筛选接种了根瘤菌 Sinorhizobium meliloti 1021 的蒺藜苜蓿根 cDNA 文库，找到一个强互作蛋白并命名为 MtLICK1；其同源蛋白 MtLICK2 也与 MtLYK3 互作，而 MtLICK1/2 与 MtNFP、MtDMI2 之间均不互作——这种特异性把 MtLICK1/2 明确放到了 MtLYK3 的信号通路上。

相互磷酸化：共生过程中 MtLICK1/2 与 MtLYK3 发生相互转磷酸化，被磷酸化的 MtLYK3 激活受体样激酶 MtDMI2，向下游传递共生信号；
突变体表型：Mtlick1/2 双突变体（R108 背景 Tnt1 插入系 NF9810/NF4329）的根瘤菌侵染与根瘤发育出现缺陷，表型与 Mtlyk3-1 一致；
免疫抑制：MtLICK1/2 在根瘤菌侵染区被激活，抑制 MAPK 激活、活性氧（ROS）爆发与免疫相关基因表达——这正是「植物如何容忍共生菌而不失防御」的直接答案。

免疫抑制这半边结论，靠的是一组细菌生长实验：植物免疫被抑制得多，病原菌就长得多。而「长多少」的读数，就来自平板上的 eGFP 菌落。

二、3415RG 在实验里承担什么

论文的免疫学实验采用 eGFP 标记的青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum），通过共接种比较不同基因型苜蓿里的菌量差异：

菌液准备：青枯雷尔氏菌在 phi 培养基中培养后清洗重悬，OD600 调至 0.02；
共接种：截形苜蓿在 BNM 培养基上培养 4-5 天，用无菌针头刺穿根尖 2cm 处根段，以 3mm×4mm 滤纸共接种 Nod 因子与菌液，对照组以 H₂O 替代 Nod 因子；
回收计数：接种后 5 天（5 dpi）取根段研磨，无菌水重悬，系列稀释后涂布 phi 培养基，28℃ 培养 48 小时；
荧光计数：eGFP 标记菌株的菌落，在 LUYOR-3415RG 荧光蛋白激发光源下计数。

逻辑很直白：Nod 因子预激活了植物的免疫抑制程序，病原菌在根里就繁殖得更多；在 Mtlick1/2 突变体里这层抑制被打破，回收菌量随之下降。平板上一个个发绿色荧光的菌落，就是「免疫抑制强弱」的定量读数。

三、为什么这类计数选荧光激发光源

整盘扫描，不用搬显微镜。150mm 激发距离下光斑直径约 180mm，一块 9cm 培养皿一次照全，肉眼扫一遍就能分辨哪些菌落带 eGFP——而荧光显微镜下数菌落，得来回移动载物台逐个确认，一盘几百个菌落很耗时间。

不破坏菌落。激发光隔着培养皿照射，菌落保持完整，计数完还能挑取阳性单菌落做复筛或摇菌保种。

双波长各司其职。LUYOR-3415RG 标准配置为 RB 宝蓝通道（440-460nm 激发、500nm 发射）加 GR 绿光通道（510-540nm 激发、600nm 发射）：前者对应 GFP、eGFP 与荧光素，后者对应 DsRed、tdTomato 与 mCherry。实验室换一种荧光标记体系，按一下开关就能切换，不必再添一台设备。

培养室前随手可用。27W 总功率、12 颗 LED，无需暗室即可激发；0.9kg 机身电池供电，从培养架搬到超净台前不费劲，长时间连续筛选也不用手持硬撑。

四、操作要点

压暗直射光：大功率输出虽不依赖暗室，但关闭视场内的直射可见光，能进一步提高 GFP 菌落与培养基背景的反差，弱表达菌落更不易漏计；
戴对眼镜：观察 GFP/eGFP 荧光配 LUV-30A 黄色荧光观察眼镜——既滤除激发光保护眼睛，又让绿色菌落在深色背景上更突出；
固定计数姿势：激发距离、照射角度与扫描路径每盘保持一致；计数规则（如菌落大小下限）提前写进方法，减少批间主观差；
拍照留证：需要图像记录时加装路阳专用遮光片与荧光拍照滤镜，培养皿平放、灯头垂直照射，一次拍全盘；
设好对照：同步保留未标记菌株平板与未接种根段的稀释涂布液，排除培养基自发荧光和杂菌污染造成的假阳性。

五、同领域的其他典型用法

GFP 标记菌的定殖观察：先用激发光源在整根、平板上做快速初筛，锁定侵染/定殖区域，再上激光共聚焦做精确定位——激发光源负责「快」，共聚焦负责「细」；
转基因毛状根筛选：发根农杆菌转化后的复合植株，用激发光源直接照根，挑 GFP 阳性根接种根瘤菌，方法可读转基因毛状根荧光筛选一文；
细菌竞争实验的菌落计数：mCherry 等红色标记体系的回收计数，可参考LUYOR-3421 台式激发光源的细菌竞争实验方案；
转基因植物阳性筛选：水稻、玉米、大豆、棉花、拟南芥等作物的种子与幼苗阳性鉴定，是这款设备在各地实验室的高频用途。

六、常见问题

LUYOR-3415RG 的两个波长分别看什么荧光？

标准配置为 RB 宝蓝通道（440-460nm 激发）看 GFP、eGFP 与荧光素，GR 绿光通道（510-540nm 激发）看 DsRed、tdTomato、mCherry。R、C、G、V、U 五种光源可任选两种出厂组装，CFP、BFP、YFP、DAPI 等体系也能配出对应组合，但组合在出厂时固定，不能现场更换。

数 eGFP 菌落用它和荧光显微镜比有什么优势？

整盘扫描、速度快，菌落不被破坏，也不需要把平板搬上显微镜。荧光显微镜的优势在亚细胞定位，平板级的菌落初筛与计数用激发光源更高效，两者是互补关系。

使用时需要暗室吗？

不需要。27W 大功率输出在常规环境光下即可激发荧光。但计数弱荧光菌落时，建议关掉视场内的直射光源、拉上遮光帘，反差会明显改善。

观察和拍照分别要配什么配件？

观察 GFP 配 LUV-30A 黄色荧光观察眼镜；拍照需加装路阳专用遮光片，并可选用 LUV-495A 等荧光拍照滤镜提升画质。主机标准配置已含两只观察眼镜与铝合金手提箱。

植物材料有自发荧光，会干扰计数吗？

叶绿素的自发荧光主要在红色光谱区，对绿色通道的 GFP 计数影响有限；根段稀释液中若混入植物碎屑，可能出现背景信号。规范做法是设未标记菌株与未接种对照，并在方法中固定稀释度与涂布量。

LUYOR-3415RG 和 3421 台式激发光源怎么选？

看工位形态：需要手持移动、照整株幼苗或大培养皿、跑田间与温室的，选便携的 3415RG；固定在实验台上、配合体视显微镜做精细观察的，选LUYOR-3421。不少实验室两台搭配，初筛与精查分工。

结语

这项 Nature 研究提醒我们：高影响力的机制结论，往往建立在一些朴实的方法环节上——把 eGFP 菌落数准、数快，免疫抑制的幅度才有说服力。LUYOR-3415RG 这类便携激发光源的价值，正在于把「荧光读数」从显微镜工位解放出来，变成培养皿前的随手动作。需要针对具体标记体系与菌株做确认，欢迎联系鑫仪胜技术同事。

文献来源：Wang D, Jin R, Shi X, Guo H, Tan X, Zhao A, et al. A kinase mediator of rhizobial symbiosis and immunity in Medicago. Nature, 2025, 643(8072): 768-775. DOI: 10.1038/s41586-025-09057-0（论文全文为付费获取，本文实验细节依据其公开摘要、图题及厂商公开应用资料整理，以原文为准）。